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Type: Dissertação
Issue Date: 29-Jul-2016
Authors: VALENTE, Juliana Vieitas
First Advisor: MIRANDA, Moysés dos Santos
Title: Efeito do meio condicionado por células tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo na maturação de oócitos bovinos e posterior desenvolvimento embrionário in vitro
Citation: VALENTE, Juliana Vieitas. Efeito do meio condicionado por células tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo na maturação de oócitos bovinos e posterior desenvolvimento embrionário in vitro. 2016. 68 f. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências Biológicas, Belém, 2016. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia.
Resumo: As células tronco são conhecidas por suas propriedades de auto-renovação, diferenciação em diversas linhagem celulares e capacidades imunomoduladores, além de expressarem um grande número de moléculas de adesão, as proteínas de matriz extracelular, citocinas e receptores para fatores de crescimento, permitindo interações com demais células. Podem ser isoladas de vários tecidos, porém as células-tronco adultas derivadas do estroma do tecido adiposo (MSC-ad) apresentam como vantagens a facilidade de isolamento, alto rendimento e baixa morbidade. Baseado nisso, a hipótese deste trabalho é verificar se o uso de meio condicionado pelas MSC-ad na maturação in vitro tem efeito sobre a as taxas de desenvolvimento de embriões bovinos. Para tanto, foi feito o isolamento e em seguida o cultivo de MSC-ad de origem bovina que se estendeu até a passagem três (P3) em meio de cultivo DMEM, suplementado com bicarbonato de sódio, 10% Soro fetal bovino (SFB), 50μl/mL de gentamicina. Quando os cultivos atingiram a confluência de 70% o meio foi substituído por TCM199 suplementado com 0.2 mM de piruvato, 50 μl/ml de gentamicina e 10% de SFB (meio de MIV). As MSC-ad foram condicionadas com meio TCM199 suplementado pelo período de 0 (Grupo CONTROLE), 24 (grupo COND-24h), 48 (grupo COND-48h) e 72 horas (grupo COND-72h), sendo que ao fim de cada período, o meio sobrenadante foi retirado, filtrado, aliquotado e congelado a -200 C. O meio foi descongelado somente no dia da MIV, e suplementado com 0,5 μl de PMSG (concentração 7UI/Ml) e 0,5 μl de HCG. Ovários de abatedouro foram puncionados para obtenção de complexos cumulus oophurus (CCOs) que foram maturados por 24 horas em microgotas de meios condicionados sob óleo mineral e incubados em estufa a 5% de CO2 com 38,5° C. A avaliação da maturação nuclear foi feita com 22 horas, em seguida realizada a ativação partenogenética somente dos oócitos que exibiam corpúsculo polar com concentração em 50 μM de ionomicina por 5 minutos, inativação com TCM199-Hepes saturado com 0,03g de BSA, seguida de incubação por 3 horas em microgotas de 2mM de 6-DMAP. Após esse período as partenogêneses foram transferidas para migrogotas de meio de cultivo in vitro. As taxas de desenvolvimento foram avaliadas no segundo e sétimo dia após a ativação. Os resultados foram analisados por ANOVA e pós-teste de Fisher adotando nível de significância de 5%. Para os grupos experimentais CONTROLE, COND-24h, COND-48h e COND-72h, obtivemos os seguinte 14 resultados, respectivamente: 83.7, 77.7, 81,4 e 76.1% de maturação nuclear; 87.5, 86,9, 74 e 80.3% de clivagem e 23.8, 27.5, 18 e 19.6% de formação de blastocisto. Não houve diferença estatística entre os grupos experimentais condicionados (p>0.05). Porém, as taxas de blastocisto foram menores quando comparadas ao meio de MIV fresco (42.1%) (p<0.05). Isto sugere que o condicionamento ou o congelamento do meio afetou a sua eficiência. Estudos futuros deverão ser realizados para avaliar os níveis dos fatores de crescimento, citocinas e quimiocinas secretadas no meio de MIV.
Abstract: Stem cells are known for their property of self-renewal, differentiation into various cell lineages and immunomodulatory capabilities, in addition to express a large number of adhesion molecules, extracellular matrix proteins, cytokines and growth factor recptors, allowing interactions with other cells. They can be isolated from various tissues, but adult stem cells derived from adipose tissue stroma (MSC-d) have the advantage of being easely isolated, high yield and low morbidity. Based on this, the study hypothesis is to verify the effect of MSC-ad conditioned medium use in in vitro maturation on development rates of bovine embryos. To this end, bovine MSC ad were isolated then cultivated until the passage three (P3) in DMEM culture medium, supplemented with sodium bicarbonate, 10% fetal bovine serum (FBS), 50mL / mL gentamicin. When cultures reached 70% confluency, the medium was replaced with TCM199 supplemented with 0.2 mM pyruvate, 50 ul / ml gentamicin and 10% FBS (IVM medium). The MSC-ad were conditioned with medium TCM199 supplemented for a period of 0 (Control Group), 24 (COND-24 group), 48 (COND-48h group) and 72 hours (COND group-72h), wherein the end of each period, the supernatant medium was removed, filtered, aliquoted and frozen at -20 0 C. The medium was thawed only on MIV day, and supplemented with 0.5 uL of PMSG (concentration 7 IU / ml) and 0.5 uL of HCG. Slaughterhouse ovaries were punctured to obtain oophurus cumulus complexes (COCs) were matured for 24 hours in microdrops of conditioned mediums under mineral oil them incubated in an incubator at 5% CO 2 at 38.5 ° C. Nuclear maturation assessment was performed with 22 hours, then held 15 parthenogenetic activation of only oocytes that exhibited polar body concentration of at least 50 uM ionomycin for 5 minutes, inactivation with TCM199-Hepes 0.03g saturated with BSA, followed by incubation for 3 hours microdroplets 2mM 6-DMAP. After this period, the parthenogenesis were transferred as microdrops to a culture medium in vitro. development rates were evaluated in the second and seventh days after activation. The results were analyzed by ANOVA and Fisher's post-test adopting a significance level of 5%. For groups: Experimental CONTROL, COND-24, COND-48h and 72h-COND, we obtained the following results respectively: 83.7, 77.7, 81.4 and 76.1% of nuclear maturation; 87.5, 86.9, 74 and 80.3 and 23.8% cleavage, 27.5, 18 and 19.6% of blastocyst formation. There was no statistical difference between condinioned experimental groups (p<0.05). However, blastocyst rates were lower when compared with fresh IVM medium (42.1%) (p<0.05). This suggests that the efficiency was affected by the conditioning of the medium or freezing. Future studies should be conducted to assess the levels of growth factors, cytokines and chemokines secreted in IVM medium.
Keywords: Reprodução animal
Células-tronco
Embriões
Fertilização in vitro
Produção in vitro de embriões
CNPq: CNPQ::CIENCIAS AGRARIAS::ZOOTECNIA
Country: Brasil
Publisher: Universidade Federal do Pará
Institution Acronym: UFPA
Department: Instituto de Ciências Biológicas
Program: Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
Appears in Collections:Dissertações em Biotecnologia (Mestrado) - PPGBIOTEC/ICB

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