Proteína PR-4 de pimenteira-do-reino (piper nigrum l.): expressão heteróloga em sistema bacteriano e avaliação funcional

Proteínas Relacionadas à Patogênese (PR) são induzidas em resposta ao ataque de patôgenos. Proteínas PR são agrupadas em 17 famílias, PR-1 a PR-17. Atividades antifúngicas e enzimáticas foram descritas para algumas dessas proteínas. Entre elas, a família PR-4 compõe as classes I e II de quitinases de plantas. Um clone de cDNA que codifica uma PR-4 da classe II, nomeada PnPR-4, foi isolado, em estudos anteriores, de Piper nigrum L. (pimenteira do reino). Esta é uma importante cultura para Brasil, principalmente no estado do Pará, no entanto sua produção tem diminuído devido à doença conhecida como podridão da raiz (Fusariose) causada pelo fungo Fusarium solani f. sp. Piperis. Neste trabalho, o cDNA da PnPR-4 foi usado para a produção da proteína recombinante, chamada de PnPR-4. O quadro de leitura aberta (ORF) da PnPR-4, foi amplificado por meio de ensaio de PCR e, em seguida a ORF foi ligada ao vetor de expressão pET-29(a) e introduzido, por eletroporação, em E. coli Rosetta (DE3). Nas células transformadas, a produção da proteína de interesse foi induzida por IPTG 1mM à 37°C por 5h. Após a produção, a atividade enzimática da proteina recombinante PnPR-4 foi avaliada pela detecção da atividade enzimática de quitinase em gel de poliacrilamida após eletroforese. A atividade foi avaliada em pH: 5.0 e pH:7.8 para demonstra a estabilidade da proteína recombinante. A massa molecular da PnPR-4 foi de 13.5 kDa, estando de acordo com outras PR-4 produzidas pelo sistema de expressão heterologa em sistema bacteriano. No ensaio de atividade enzimática, a PnPR-4 apresentou atividade quitinolitica, tanto em pH:5.0 ou pH:7.8. Esta é uma característica de chitinases de plantas, atividade em uma ampla faixa de pHs. Onde, a atividade ótima ocorre entre pH: 3.0 e 5.0. Na proteína recombianante, o pH ótimo foi 5.0, no entato ela teve atividade em pH 7.8, demonstrando a estabilidade da enzima. Estes resultados mostram que o sistema bacteriano de expressão heteróloga é eficaz para a produção da proteína recombinante PnPR-4, que é uma enzima com atividade quitinolitica e altamente estável. Assim, a PnPR-4 é uma nova enzima que pode ser usado em biotecnologia vegetal no combate contra fungos patogênicos da planta.